Introducción
⌅Las abejas melíferas (Apis Mellifera)
producen el propóleos mediante la mezcla de material lipofílico
proveniente de las yemas y hojas de los árboles, así como también el
mucilago, la resina de origen vegetal con cera y enzimas salivales. Su
principal función dentro de la colmena es el sellado de agujeros
pequeños y fortalecer los bordes del- gados y débiles. También actúa
como biocida y puede presentar actividad contra hongos y bacterias
invasoras e incluso en las que afectan las larvas (Bankova et al., 2019Bankova,
V., Bertelli, D., Borba, R., Conti, B. J., da Silva Cunha, I. B.,
Danert, C., . . . Moreno, M. I. N. (2019). Standard methods for Apis
mellifera propolis research. Journal of Apicultural Re- search, 58(2),
1-49.
; Benhanifia & Soltani, 2022Benhanifia, M., & Soltani, A. (2022). Biological Activity of Propolis: An Update.
; Daniel S Dezmirean et al., 2017Dezmirean,
D. S., Mărghitaş, L. A., Chirilă, F., Copaciu, F., Simonca, V., Bobiş,
O., & Erler, S. (2017). Influence of geographic origin, plant source
and polyphenolic substances on antimicrobial properties of propolis
against human and honey bee pathogens. Journal of Apicultural Research,
56(5), 588-597.
).
En la actualidad, el propóleos
y sus extractos se utilizan en la industria farmacéutica por sus
propiedades antibacterianas, anti-inflamatorias, antioxidantes,
inmunoestimulantes, su actividad anti-fúngica, antiviral, anticaries, y
anti-cancerígenas (Zhu et al., 2023Zhu,
L., Zhang, J., Yang, H., Li, G., Li, H., Deng, Z., & Zhang, B.
(2023). Propolis polyphenols: A review on the composition and
anti-obesity mechanism of different types of propolis polyphenols.
Frontiers in Nutrition, 10, 511.
). Además, se ha extendido su uso dado el aumento de la resistencia humana o animal a las infecciones (Sforcin, 2016Sforcin, J. M. (2016). Biological properties and therapeutic applications of propolis. Phytotherapy research, 30(6), 894-905.
).
El
valor del propóleos, tanto económico como social, se ha demostrado
mediante su utilización como promotor de la salud y la nutrición (Braakhuis, 2019Braakhuis, A. (2019). Evidence on the health benefits of supple- mental propolis. Nutrients, 11(11), 2705.
).
La actividad biológica del propóleos está marcada por su composición
química, que a su vez está determinada por la fuente de origen vegetal a
partir de la cual se produjo, tiempo de recolección y origen geográfico
de este producto apícola (Bankova et al., 2019Bankova,
V., Bertelli, D., Borba, R., Conti, B. J., da Silva Cunha, I. B.,
Danert, C., . . . Moreno, M. I. N. (2019). Standard methods for Apis
mellifera propolis research. Journal of Apicultural Re- search, 58(2),
1-49.
). Las principales familias de compuestos que se
encuentran en el propóleos incluyen los ácidos fenólicos, flavonoides,
ésteres, aldehídos aromáticos, aminoácidos, ácidos grasos, vitaminas,
minerales, entre otros (Cîrţînă, 2023Cîrţînă,
D. (2023). Antioxidant capacities of propolis-therapeutic effects and
possible applications. Journal of Research & Innovation for
Sustainable Society (JRISS), 5(1).
). Las sustancias más representativas que tributan a dicha actividad biológica son los ácidos fenólicos y flavonoides (Nichitoi et al., 2021Nichitoi,
M. M., Josceanu, A. M., Isopescu, R. D., Isopencu, G. O., Geana, E.I.,
Ciucure, C. T., & Lavric, V. (2021). Polyphenolics profile effects
upon the antioxidant and antimicrobial activity of propolis extracts.
Scientific Reports, 11(1), 1-12.
).
La validación
de un método es de suma importancia pues aporta la veracidad del mismo
en la obtención de un resultado. En la actualidad se trabaja en la
caracterización de los propóleos cubanos, y se necesita un método
eficiente para la determinación de los flavonoides totales en este
producto apícola. También es de interés comercial la cuantificación de
estos metabolitos secundarios pues ofrece un mayor valor agregado al
producto. Además, las regulaciones actuales del control de calidad
exigen como parte del proceso de acreditación de una técnica analítica
la validación previa de la misma. ("ISO/IEC 17025:2017 (es). Requisitos generales para la competencia de los laboratorios de ensayo y calibración," 2017ISO/IEC 17025:2017(es). Requisitos generales para la competencia de los laboratorios de ensayo y calibración, (2017).
)
Materiales y Métodos
⌅Muestras de propóleos
⌅Las muestras de propóleos fueron colectadas en el período del año 2020 por el método de raspado tradicional. Las mismas fueron tomadas directamente de los apiarios de diferentes provincias de Cuba (Camagüey, Ciego de Ávila, Holguín, Mayabeque, Pinar del Río, Sancti Spíritus, y Santiago de Cuba). Las muestras fueron almacenadas en refrigeración hasta que se realizaron los extractos etanólicos correspondientes. Los mismos se almacenaron identificados de manera correcta a temperatura ambiente (25ºC).
Para la preparación de los extractos se añadieron 50 mL de etanol (96%) por cada 5 g de propóleos. La mezcla se introdujo en incubadora con zaranda a 110 rpm, 40 °C durante 72 h. Al cabo de este tiempo se filtró, y al sólido obtenido se le repitió el proceso desde la incubación, esta vez añadiendo 20 mL de etanol (96 %) por cada 5 g de propóleos. Este último se vuelve a filtrar y se unifica con el primero. La disolución resultante se coloca en congelación durante 24 h y se vuelve a filtrar (en frío) para separar la cera. El extracto así obtenido se almacena en un recipiente hermético no esmerilado hasta su uso.
Preparación de la muestra
⌅Se tomó 0,1 mL del extracto etanólico de propóleos y se añadió a un volumétrico de 25 mL. En este último se adicionaron 0,5 mL de disolución de cloruro de aluminio (Panreac, España) (disolución al 5 % en metanol), completando con metanol y homogeneizando al finalizar. La mezcla de reacción fue dejada reposar 30 minutos en la oscuridad, permitiendo la formación del complejo de color amarillo. La medición se realizó a 415 nm en espectrofotómetro utilizando una disolución blanco preparada con 0,1 mL de alcohol etílico (96%) en vez de la disolución de propóleos, manteniendo las mismas condiciones y tiempo de reacción. A todas las muestras se les realiza el análisis por duplicado o triplicado.
Validación del método
⌅Los
parámetros de linealidad, límite de cuantificación, precisión
intermedia, repetibilidad y exactitud fueron los estudiados para el
proceso de validación. Para estos estudios se emplearon propóleos
clasificados como tipo I, II, III (Cuesta-Rubio et al., 2007Cuesta-Rubio,
O., PiccinellI, A. L., Fernández, M. C., Hernández, I. M., Rosado, A.,
& Rastrelli, L. (2007). Chemical Characterization of Cuban Propolis
by HPLC-PDA, HPLC-MS, and NMR: the Brown, Red, and Yellow Cuban
Varieties of Propolis. Journal of Agricultural and Food Chemistry,
55(18), 7502-7509.
).
Para el estudio de
linealidad se obtuvo una curva de calibración por triplicado con cinco
puntos (2, 4, 6, 8 y 10 µg/ mL). Las mismas se prepararon teniendo en
cuenta la Norma Argentina IRAM-INTA 15935-1 respecto a los propóleos en
bruto ("Norma Argentina IRAM-INTA 15935- 1:2008Norma Argentina IRAM-INTA 15935-1:2008: productos del NOA (noroeste argentino). Propóleos. Parte 1- propóleos en bruto, (2008).
:
productos del NOA (noroeste argentino). Propóleos. Parte 1- propóleos
en bruto," 2008). Las disoluciones de calibración se prepararon a partir
de un patrón primario de quercetina de 1000 µg/mL. Los parámetros y
estadígrafos considerados para la prueba fueron: el coeficiente de
determinación (R2), la significación del intercepto, la pendiente y la comparación de posibles modelos de correlación alternativos.
La estimación del límite de cuantificación fue realizada a partir de la curva de calibración con el empleo de la ecuación:
siendo LC, el límite de cuantificación; S, la desviación estándar y p; pendiente de la curva de calibración.
La repetibilidad fue estimada a través del coeficiente de variación (CV) para tres muestras de varios tipos de propóleos y nueve réplicas de cada uno.
La precisión intermedia se realizó entre dos analistas en dos días diferentes para tres tipos de propóleos. A partir de los resultados, fue determinado el coeficiente de variación (CV) para cada muestra en un mismo equipo espectrofotométrico
El estudio de exactitud se llevó a cabo mediante el método de añadido-recobrado, utilizando quercetina y añadiéndola en cantidades seleccionadas (10, 15 y 20 µg/mL) sobre nueve muestras de propóleos pertenecientes a diferentes tipos (I, II y III). Tras las mediciones, se estimaron, mediante cálculos, los porcentajes de recobrado.
La metodología se aplicó a diferentes muestras de extractos de propóleos provenientes del campo y preparadas según la metodología antes descrita.
Resultados y Discusión
⌅Para la realización de la presente validación se seleccionó el metanol como el disolvente ideal, tanto para la prepa- ración de muestras, como para la preparación de la disolución de cloruro de aluminio al 5 %. El uso del metanol puro como disolvente es completamente necesario. Ensayos equivalentes con etanol no permitieron mediciones correctas probablemente debido a la formación de un complejo acuoso de cierta estabilidad con el ión Al3+, relacionado con diferentes grados de hidratación del etanol, que evita la correspondiente reacción de acomplejamiento con los flavonoides presentes en los propóleos. En este caso se trabajó de manera directa con los extractos etanólicos de propóleos al 5 %, lo cual no tuvo ninguna in- fluencia negativa en las mediciones.
El principio del método colorimétrico del cloruro de
aluminio se basa en la formación de compuestos complejos ácidos estables
con el grupo ceto C-4 y el grupo hidroxilo C3 o C5 de flavonas o
flavononas Además, el cloruro de aluminio forma complejos ácidos lábiles
con los grupos orto-dihidroxilo en el anillo A o B de los flavonoides (Mabry, Markham, & Thomas, 2012Mabry,
T., Markham, K. R., & Thomas, M. B. (2012). The systematic
identification of flavonoids: Springer Science & Business Me- dia.
).
Chang y col. (2002)Chang,
C.C., Yang, M.-H., Wen, H.-M., & Chern, J.C. (2002). Estimation of
total flavonoid content in propolis by two complementary colorimetric
methods. Journal of food and drug analysis, 10(3).
estudiaron el contenido de flavonoides totales en muestras de propóleos
provenientes de diferentes países (Taiwán, Brasil, y China). En este
trabajo realizaron estudios de barridos electrónicos de complejos de 15
patrones de flavonoides con cloruro de aluminio. Estos análisis
mostraron que los complejos formados por flavonoles con grupos hidroxilo
C-3 y C-5, como galangina, morina y kaempferol, así como aquellos con
grupos orto-dihidroxilo extras, como rutina, quercetina, quercitrina y
miricetina, tenían una absorbancia máxima a 415- 440 nm. Sin embargo, el
máximo de absorción de los complejos formados por crisina y apigenina
que tienen solo los grupos hidroxilo C-5 y ceto C-4 fue de 395 y 385 nm,
respectivamente. Otro compuesto de flavona que investigaron, la
luteolina, tiene el grupo hidroxilo C-5 y los grupos orto-dihidroxilo en
el anillo B formaron un complejo que mostró una fuerte absorción a 415
nm (Chang, Yang, Wen, & Chern, 2002Chang,
C.C., Yang, M.-H., Wen, H.-M., & Chern, J.C. (2002). Estimation of
total flavonoid content in propolis by two complementary colorimetric
methods. Journal of food and drug analysis, 10(3).
).
Para tener una noción del comportamiento de los propóleos cubanos seleccionados, se realizó una comparación entre los espectros de absorción del complejo quercetina- Al3+ y el complejo propóleos-Al3+ (figura 1). En primera instancia se hace evidente que los propóleos tipo II poseen una mayor concentración de flavonoides pues poseen mayor absorbancia, pero incluso en este caso, no coinciden con el máximo de absorción del complejo quercetina- Al3+ (450 nm). Sin embargo, dado la complejidad en la composición química de los propóleos (que pudiesen presentar otros compuestos que absorban a longitudes de ondas cercanas), la diversidad de flavonoides presentes, y lo reportado en la literatura, se decidió trabajar a 415 nm.
Linealidad
⌅A
partir de la obtención de la curva de calibración, se procedió a
realizar el cálculo de la ecuación de regresión, la significación del
intercepto, el coeficiente de determinación (R2) por mínimos
cuadrados y la prueba de falta de ajuste, mediante el empleo del
software StatGraphics 19. El método mostró, en el rango de
concentraciones en estudio, un coeficiente de determinación (R2)
de 0,9998. El p-valor del intercepto (0,4655) demostró que este no
difiere de cero por lo que se manifiesta un correcto comportamiento de
la ley de Lambert- Beer (Rusell & Martí, 2003Rusell, J. R., & Martí, R. B. (2003). Calibración Lineal. Dialnet. Técnicas de laboratorio (284), 676-680.
).
Al comparar con otros modelos alternativos, el factor de correlación
resultante fue de 0,9997, siendo uno de los más adecuados para describir
el comportamiento de los datos. En la opinión de los autores, se puede
considerar una respuesta lineal para explicar la relación entre la
propiedad medida y la concentración.
Límite de cuantificación
⌅Se determinan los valores de las pendientes a partir de las mediciones de las absorbancias para cada nivel de concentración. En la estimación, se hallaron la media y la desviación estándar, con ello, el LC. Después de realizar el cálculo se estimó que el límite de cuantificación para este método es de 0,091 µg/mL.
Precisión en condiciones de repetibilidad
⌅La repetibilidad se evaluó al determinar el contenido de flavonoides totales en tres muestras de propóleos, una representativa de cada tipo (I, II, III), por el mismo analista, el mismo día y el mismo equipo. El resultado se expresa como CV (tabla 1). Para cada uno de los propóleos que se estudiaron los coeficientes de variación estuvieron por debajo del 5 %. Este resultado indica la poca variabilidad que presenta esta metodología.
Precisión intermedia
⌅El estudio se llevó a cabo de la manera descrita anterior- mente y fueron analizadas tres réplicas para cada uno de los propóleos seleccionados (Tipos I, II, III). La precisión intermedia se determinó por el CV (%), (tabla 1 a, b, y c).
| Muestra | c (µg/mL) | SD | CV |
|---|---|---|---|
| HL-6 (Tipo I) | 7,09 | 0,26 | 3,72 |
| PR-G2 (Tipo II) | 2,80 | 0,08 | 3,00 |
| SS-9 (Tipo III) | 5,18 | 0,14 | 2,66 |
| HL-6 | |||||
|---|---|---|---|---|---|
| Analista I/ c(µg/mL) | Analista II/ c(µg/mL) | Media | SD | CV | |
| Día I | 7,25 | 7,27 | 7,26 | 0,13 | 1,74 |
| Día II | 7,80 | 7,64 | 7,72 | 0,20 | 2,59 |
| Media | 7,53 | 7,46 | Total | ||
| SD | 0,35 | 0,24 | Media | SD | CV |
| CV | 4,62 | 3,18 | 7,49 | 0,29 | 3,82 |
| PR-G2 | |||||
|---|---|---|---|---|---|
| Analista I/ c(µg/mL) | Analista II/ c(µg/mL) | Media | SD | CV | |
| Día I | 2,99 | 2,93 | 2,96 | 0,05 | 1,74 |
| Día II | 3,02 | 3,08 | 3,05 | 0,05 | 1,64 |
| Media | 3,01 | 3,00 | Total | ||
| SD | 0,05 | 0,09 | Media | SD | CV |
| CV | 1,53 | 3,01 | 3,01 | 0,07 | 2,28 |
| SS-9 | |||||
|---|---|---|---|---|---|
| Analista I/ c(µg/mL) | Analista II/ c(µg/mL) | Media | SD | CV | |
| Día I | 5,43 | 5,36 | 5,40 | 0,11 | 2,11 |
| Día II | 5,68 | 5,75 | 5,71 | 0,12 | 2,14 |
| Media | 5,56 | 5,56 | Total | ||
| SD | 0,14 | 0,26 | Media | SD | CV |
| CV | 2,53 | 4,73 | 5,56 | 0,20 | 3,61 |
Los coeficientes de variación que se obtuvieron se encontraron entre 2,28 - 3,82 %, por debajo del 5 % en todos los casos. Con estos resultados se verificó que los resultados son independiente a la experiencia del analista así como el día de medición por lo que el método tiene poca variación en condiciones de medición intralaboratorio.
Exactitud
⌅El estudio de exactitud se realizó sobre nueve muestras de propóleos pertenecientes a diferentes tipos (I, II y III), para tener una visión más completa del procedimiento. Se calcularon los porcentajes de recobrado a partir de las mediciones de las concentraciones añadidas de cada propóleos (tabla 2). Los porcentajes de recobrado estuvieron en un rango de 79,1-101,9 %. Desde el punto de vista de los autores se puede considerar adecuado este resultado, dada la gran variación entre la composición química de estos propóleos, los que pueden presentar numerosos compuestos interferentes que produzcan las variaciones observadas.
| Tipo | Provincia | Propóleos | % recuperación | ||
|---|---|---|---|---|---|
| 10 µg/mL | 15 µg/mL | 20 µg/mL | |||
| I | Holguín | HL-4 | 96,3 | 90,5 | 96,6 |
| Ciego de Ávila | CA-4 | 79,1 | 94,1 | 101,9 | |
| Santiago de Cuba | SC-2 | 79,1 | 100,9 | 79,6 | |
| II | Pinar del Río | PR-2 | 81,2 | 89,9 | 90,0 |
| Mayabeque | MY-G | 81,3 | 102,2 | 92,5 | |
| Pinar del Río | PR-1 | 80,0 | 98,0 | 90,0 | |
| III | Camagüey | CM-1 | 81,4 | 99,4 | 107,1 |
| Sancti Spíritus | SS-7 | 89,5 | 94,0 | 93,3 | |
| Holguín | H-1 | 85,6 | 90,5 | 96,6 | |
Análisis preliminares
⌅Los resultados se expresan en milígramos de flavonoides por gramos de sólidos solubles (mg/g). Estos últimos determinados según Norma Argentina ("Norma Argentina IRAM-INTA 15935-1:2008 : productos del NOA (noroeste argentino). Propóleos. Parte 1- propóleos en bruto," 2008). La ecuación siguiente expresa la forma de cálculo:
siendo c[mg/g]: milígramos de flavonoides por gramos de sólidos solubles; c[µg/mL]: concentración de flavonoides estimados a partir de la curva de calibración; m[g]: masa de sólidos disueltos por mililitro de extracto utilizado; 400: factor de ajuste.
Los resultados preliminares permitieron medir el contenido de flavonoides en 20 muestras de propóleos de diferentes grupos y estimar su riqueza de flavonoides (tabla 3).
A partir de los resultados preliminares que fueron obtenidos, es notorio observar que existe variación en la concentración de flavonoides según la provincia de origen de la muestra, e incluso dentro de una misma provincia. En la provincia de Pinar del Río se obtuvieron los mayores valores de concentración de flavonoides en los extractos preparados con los propóleos (figura 2).
Al comparar según el tipo de propóleos, los de tipo I y III, presentaron un comportamiento similar en su concentración de flavonoides, mientras que los de tipo II fueron los de mayor concentración de estos analitos cuyos componentes distintivos son los isoflavonoides (figura 3). Este resultado coincide con lo reportado en la literatura según la composición química y tiene importancia cuando este parámetro sea utilizado como criterio en alguna aplicación o dosificación.
Es
conocido como varía la composición de los propóleos según su origen
geográfico, y la dependencia directa de este hecho con su origen
botánico ( Daniel Severus Dezmirean, Paşca, Moise, & Bobiş, 2020Dezmirean,
D. S., Paşca, C., Moise, A. R., & Bobiş, O. (2020). Plant sources
responsible for the chemical composition and main bioactive properties
of poplar-type propolis. Plants, 10(1), 22.
). Las principales fuentes vegetales resiníferas en Cuba son el Pino (Pinus L.), Almacigo (Bursera simaruba), Guaguasí (Zuelania guidonia), Manajú (Rhheedia aristata), Ocuje (Calophyllum Antillanum Britt), Mango (Mangifera indica L.), y Aguacate (Persea americana).
Sin embargo, la contribución de cada una de estas especies a un tipo de
propóleos determinado viene dado por su posición y cercanía al Apiario
por lo que es usual esperar cierta variabilidad ya sea entre provincias o
dentro de una misma provincia. En el caso de los tipos de propóleos, al
parecer y en general, se mantiene como tendencia que los de mayor
concentración sean los del tipo I.
| Tipo | Provincia | Muestra | c/[mg/g] |
|---|---|---|---|
| I | Villa Clara | VC-2 | 24,4 ± 0,4 |
| Matanzas | MT-2 | 22,6 ± 0,8 | |
| Santiago de Cuba | SC-1 | 45,8 ± 3,4 | |
| SC-5 | 21,6 ± 0,2 | ||
| Guantánamo | GT-4 | 58,3 ± 2,0 | |
| Granma | GR-1 | 31,4 ± 1,0 | |
| Mayabeque | MYB-3 | 74,4 ± 0,4 | |
| Holguín | HL-6 | 75,3 ± 2,2 | |
| II | Pinar del Río | PR-1 | 159,4 ± 1,5 |
| PR-2 | 119,3 ± 3,3 | ||
| PR-G2 | 30,3 ± 1,5 | ||
| Matanzas | MT-1 | 100,4 ± 6,1 | |
| Guantánamo | GT-3 | 152,0 ± 2,6 | |
| III | Sancti Spíritus | SS-5 | 46,0 ± 3,0 |
| SS-7 | 18,0 ± 1,3 | ||
| SS-9 | 54,7 ± 3,0 | ||
| Camagüey | CM-1 | 29,0 ± 0,2 |
Conclusiones
⌅Se validó el método espectrofotométrico en estudio para la determinación de flavonoides totales para su evaluación en propóleos cubanos. Los parámetros de validación cumplen con lo establecido en las regulaciones actuales cubanas e internacionales, siendo lineal, preciso y exacto en los rangos estudiados e independiente del tipo de propóleos y de su origen geográfico. El método es factible para su utilización en el análisis del contenido de flavonoides totales en propóleos. En los estudios preliminares se pudo observar la gran variación que existe entre las muestras de los propóleos cubanos lo cual muestra la gran variedad en la composición química de estos.